迄今，由 RNA 引導的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)已經(jīng)有十多年的發(fā)展歷史。期間，有許多新的技術(shù)被開發(fā)出來，并被用于生物學和醫(yī)學等領(lǐng)域的研究中，比如，了解疾病的遺傳基礎(chǔ)、通過編程逆轉(zhuǎn)疾病狀態(tài)的工程細胞治療等。

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在此基礎(chǔ)上，為了進一步落實基因組編輯技術(shù)在基礎(chǔ)研究、細胞工程和基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用，相關(guān)領(lǐng)域的研究人員正在緊鑼密鼓地開發(fā)更好的方法，希望能將 CRISPR-Cas 系統(tǒng)更有效地遞送至原代細胞。

雖然已經(jīng)有許多種（病毒載體、電穿孔和小分子藥物等）CRISPR-Cas 系統(tǒng)的遞送方法，但這些方法各自都存在著局限性。

具體來說，如果采用病毒式方法，病毒會不可避免地被整合到人的基因組，且會永遠和人類的細胞一同存在，這會導致諸多安全問題。比如，若病毒載入的位點影響人類的抑癌基因，可能導致細胞發(fā)展為癌細胞；若病毒插入的位點不適合基因的表達，會造成低效率的基因編輯。并且，這種方法對載體的大小也有限制，無法包裹那些較大的載體。

如果采用電穿孔法，即先通過高電壓擊穿細胞膜，再將 CRISPR 的載體導入細胞中，會給細胞的活力和激活狀態(tài)造成損傷。如果采用小分子化學藥物包裹 mRNA 的方法，將載體遞送到細胞中，會造成較高的生產(chǎn)成本，以及在細胞水平的表達量不統(tǒng)一，且 mRNA 也非常不穩(wěn)定。

“要是我們能開發(fā)出一種方法，可以不用病毒、電擊、mRNA，而是只用蛋白來實現(xiàn)基因編輯，就極大可能彌補當前那些傳統(tǒng)方法存在的缺陷。”美國賓夕法尼亞大學史俊煒副教授表示。

圖丨史俊煒（來源：史俊煒）

基于上述設(shè)想，他和團隊設(shè)計了一套多肽輔助的純蛋白基因組編輯（Peptide-Assisted Genome Editing，PAGE）的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)（以下簡稱為 CRISPR-PAGE 系統(tǒng)），在方便、高效、無毒性的條件下，實現(xiàn)了對原代細胞的基因組編輯。研究結(jié)果顯示，該系統(tǒng)在小鼠和人類原代 T 細胞中，能夠?qū)崿F(xiàn)高達 98% 的編輯效率；在人類原代造血干細胞和祖細胞中，則能夠?qū)崿F(xiàn)接近 100% 的基因編輯效率。

圖丨CRISPR-PAGE 系統(tǒng)的開發(fā)（來源：Nature Biotechnology）

值得一提的是，CRISPR-PAGE 系統(tǒng)由穿透細胞的 Cas 蛋白和穿透細胞的核內(nèi)體逃逸肽組成，只需 30 分鐘的孵育期，就能在將細胞毒性和基因轉(zhuǎn)錄干擾降至最低的同時，實現(xiàn)強大的單基因組和多基因組編輯。

那么，具體來說，單基因組和多基因組編輯究竟是如何實現(xiàn)的呢？

“由于細胞膜和核膜都由脂類組成且?guī)ж撾姡虼宋覀兙拖耄绻茉?CRISPR 蛋白的表面修飾足夠多的正電或親脂疏水性基團，這個 CRISPR 蛋白就會直接融合且穿透細胞膜和核膜，進而實現(xiàn)基因編輯。并且，在該方法中，蛋白和細胞之間是共孵育的，所以要實現(xiàn)單基因或多基因，只用孵育不同的蛋白即可。”史俊煒解釋道。

同時，他也強調(diào)，該方法最大的應(yīng)用意義在于，CRISPR-PAGE 系統(tǒng)是基于細菌生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低、狀態(tài)穩(wěn)定、易于運輸，同時也容易實現(xiàn)基因編輯，且編輯完后不留任何痕跡，也就是原代細胞里剩下的 CRISPR 的所有系統(tǒng)，會在兩天之內(nèi)完全清除。

2023 年 4 月 24 日，相關(guān)論文以《利用肽輔助基因組編輯的人類和小鼠原代細胞高效工程》（Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing）為題在 Nature Biotechnology 上發(fā)表[1]。

圖丨相關(guān)論文（來源：Nature Biotechnology）

賓夕法尼亞大學博士后研究員張珍為該論文的第一作者，賓夕法尼亞大學免疫學研究所所長 E·約翰·惠里（E. John Wherry）、賓夕法尼亞大學表觀遺傳學所長雪萊·L·伯杰（Shelley L. Berger）教授和史俊煒副教授擔任論文的共同通訊作者。

在這項研究中，該團隊主要把 CRISPR-PAGE 系統(tǒng)用于人類的 T 細胞和血液干細胞中。事實上，包括巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等在內(nèi)的許多來自血液的細胞，都可以通過該系統(tǒng)實現(xiàn)基因編輯。

并且，如上所述，該方法是讓帶正電或帶親脂疏水基團的 CRISPR，通過帶負電的細胞膜和核膜，遵循了基因正負電相互作用和脂類融合的原則，因此能為原代細胞的下一代基因工程，提供廣泛通用的平臺。

此外，該方法雖然已經(jīng)實現(xiàn)了單基因或多基因敲除，但未來的基因編輯或細胞治療方法，還要求能夠達到單點突變、多點突變或整個基因的更換。因此，該團隊后續(xù)也計劃對該方法進行進一步的升級。

“雖然我們研究的這個方法是基于 CRISPR 的基因改造，但只要能夠找到合適的表面帶正電或具有親脂疏水性的結(jié)構(gòu)，其還能用于其他大分子或基于蛋白質(zhì)的治療遞送，并有助于更多潛在治療方法的開發(fā)。”史俊煒表示。

參考資料：

1. Zhang, Z., Baxter, ., Ren, D. et al. Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing. Nature Biotechnology (2023). /s41587-023-01756-1

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