迄今,由 RNA 引導的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)已經(jīng)有十多年的發(fā)展歷史。期間,有許多新的技術(shù)被開發(fā)出來,并被用于生物學和醫(yī)學等領(lǐng)域的研究中,比如,了解疾病的遺傳基礎(chǔ)、通過編程逆轉(zhuǎn)疾病狀態(tài)的工程細胞治療等。
【資料圖】
在此基礎(chǔ)上,為了進一步落實基因組編輯技術(shù)在基礎(chǔ)研究、細胞工程和基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用,相關(guān)領(lǐng)域的研究人員正在緊鑼密鼓地開發(fā)更好的方法,希望能將 CRISPR-Cas 系統(tǒng)更有效地遞送至原代細胞。
雖然已經(jīng)有許多種(病毒載體、電穿孔和小分子藥物等)CRISPR-Cas 系統(tǒng)的遞送方法,但這些方法各自都存在著局限性。
具體來說,如果采用病毒式方法,病毒會不可避免地被整合到人的基因組,且會永遠和人類的細胞一同存在,這會導致諸多安全問題。比如,若病毒載入的位點影響人類的抑癌基因,可能導致細胞發(fā)展為癌細胞;若病毒插入的位點不適合基因的表達,會造成低效率的基因編輯。并且,這種方法對載體的大小也有限制,無法包裹那些較大的載體。
如果采用電穿孔法,即先通過高電壓擊穿細胞膜,再將 CRISPR 的載體導入細胞中,會給細胞的活力和激活狀態(tài)造成損傷。如果采用小分子化學藥物包裹 mRNA 的方法,將載體遞送到細胞中,會造成較高的生產(chǎn)成本,以及在細胞水平的表達量不統(tǒng)一,且 mRNA 也非常不穩(wěn)定。
“要是我們能開發(fā)出一種方法,可以不用病毒、電擊、mRNA,而是只用蛋白來實現(xiàn)基因編輯,就極大可能彌補當前那些傳統(tǒng)方法存在的缺陷。”美國賓夕法尼亞大學史俊煒副教授表示。
圖丨史俊煒(來源:史俊煒)
基于上述設(shè)想,他和團隊設(shè)計了一套多肽輔助的純蛋白基因組編輯(Peptide-Assisted Genome Editing,PAGE)的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)(以下簡稱為 CRISPR-PAGE 系統(tǒng)),在方便、高效、無毒性的條件下,實現(xiàn)了對原代細胞的基因組編輯。研究結(jié)果顯示,該系統(tǒng)在小鼠和人類原代 T 細胞中,能夠?qū)崿F(xiàn)高達 98% 的編輯效率;在人類原代造血干細胞和祖細胞中,則能夠?qū)崿F(xiàn)接近 100% 的基因編輯效率。
圖丨CRISPR-PAGE 系統(tǒng)的開發(fā)(來源:Nature Biotechnology)
值得一提的是,CRISPR-PAGE 系統(tǒng)由穿透細胞的 Cas 蛋白和穿透細胞的核內(nèi)體逃逸肽組成,只需 30 分鐘的孵育期,就能在將細胞毒性和基因轉(zhuǎn)錄干擾降至最低的同時,實現(xiàn)強大的單基因組和多基因組編輯。
那么,具體來說,單基因組和多基因組編輯究竟是如何實現(xiàn)的呢?
“由于細胞膜和核膜都由脂類組成且?guī)ж撾姡虼宋覀兙拖耄绻茉?CRISPR 蛋白的表面修飾足夠多的正電或親脂疏水性基團,這個 CRISPR 蛋白就會直接融合且穿透細胞膜和核膜,進而實現(xiàn)基因編輯。并且,在該方法中,蛋白和細胞之間是共孵育的,所以要實現(xiàn)單基因或多基因,只用孵育不同的蛋白即可。”史俊煒解釋道。
同時,他也強調(diào),該方法最大的應(yīng)用意義在于,CRISPR-PAGE 系統(tǒng)是基于細菌生產(chǎn),生產(chǎn)成本低、狀態(tài)穩(wěn)定、易于運輸,同時也容易實現(xiàn)基因編輯,且編輯完后不留任何痕跡,也就是原代細胞里剩下的 CRISPR 的所有系統(tǒng),會在兩天之內(nèi)完全清除。
2023 年 4 月 24 日,相關(guān)論文以《利用肽輔助基因組編輯的人類和小鼠原代細胞高效工程》(Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing)為題在 Nature Biotechnology 上發(fā)表[1]。
圖丨相關(guān)論文(來源:Nature Biotechnology)
賓夕法尼亞大學博士后研究員張珍為該論文的第一作者,賓夕法尼亞大學免疫學研究所所長 E·約翰·惠里(E. John Wherry)、賓夕法尼亞大學表觀遺傳學所長雪萊·L·伯杰(Shelley L. Berger)教授和史俊煒副教授擔任論文的共同通訊作者。
在這項研究中,該團隊主要把 CRISPR-PAGE 系統(tǒng)用于人類的 T 細胞和血液干細胞中。事實上,包括巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等在內(nèi)的許多來自血液的細胞,都可以通過該系統(tǒng)實現(xiàn)基因編輯。
并且,如上所述,該方法是讓帶正電或帶親脂疏水基團的 CRISPR,通過帶負電的細胞膜和核膜,遵循了基因正負電相互作用和脂類融合的原則,因此能為原代細胞的下一代基因工程,提供廣泛通用的平臺。
此外,該方法雖然已經(jīng)實現(xiàn)了單基因或多基因敲除,但未來的基因編輯或細胞治療方法,還要求能夠達到單點突變、多點突變或整個基因的更換。因此,該團隊后續(xù)也計劃對該方法進行進一步的升級。
“雖然我們研究的這個方法是基于 CRISPR 的基因改造,但只要能夠找到合適的表面帶正電或具有親脂疏水性的結(jié)構(gòu),其還能用于其他大分子或基于蛋白質(zhì)的治療遞送,并有助于更多潛在治療方法的開發(fā)。”史俊煒表示。
參考資料:
1. Zhang, Z., Baxter, ., Ren, D. et al. Efficient engineering of human and mouse primary cells using peptide-assisted genome editing. Nature Biotechnology (2023). /s41587-023-01756-1
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